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腺相关病毒（AAV）已成为科学研究和临床应用中最受欢迎的病毒工具。AAV可用于在多种细胞中瞬时表达目的基因。大约50年前，它首次被描述为腺病毒制剂的污染物，因此得名腺相关病毒（Atchison et al., 1965）。AAV属于细小病毒科的单链DNA病毒。它是由包装在二十面体衣壳中的“简单”基因组构成。它没有脂质外壳，也称为包膜，因此不能支持向其表面添加糖蛋白，如VSV-G。在研究应用中，通常将基因组去除，以便为基因传递提供宝贵的空间并增加安全性。通过提供编码复制功能的酶和衣壳蛋白的基因，您可以在组织培养环境中轻松构建病毒。这使研究人员能够在受控环境中产生更多病毒。尽管AAV可从多种生物中分离出来的，但它与疾病无关，它被认为是生物安全1级（BSL1）病毒。

重组AAV (rAAV)工具的优化设计

AAV可用于多种应用，包括特定细胞类型中的瞬时基因表达，CRISPR基因组编辑，光遗传学和化学遗传学实验。如果您不熟悉使用rAAV作为基因传递工具，那么在开始实验之前您应该考虑以下事项：

1、基因载量：即使除去基因组的rAAV也只具有~4.7 kb的基因载量，这是该病毒用于基因载体的关键限制之一。然而，如果您感兴趣的基因足够小，您可以设计单个rAAV载体，其中包含两个基因，并使用IRES或2A等元件用一个启动子共表达它们。如果滴度很高，不同rAAV的共转染率也相当高。所以如果不能将两个基因同时放在一个载体中，您可以考虑共转染方式（尽管这可能并不总是在体内有效）。

2、特异性：有一些不同的rAAV成分可以驱动特定细胞/组织中的基因表达; 这些成分包括启动子，Flp或Cre依赖性基因开关，以及血清型（血清型将在下面更详细地讨论）。如果您的目标是广泛表达，那么广泛活跃的启动子，如CAG（具有CMV即时早期增强子的鸡β肌动蛋白启动子），是一个不错的选择。如果您有特定的靶细胞类型，您可能想尝试不同的启动子，例如，CamkIIa具有神经元特异性。另一方面，具有Cre或Flp依赖性基因表达的rAAV载体可以注射到具有在特定细胞类型中表达Cre或Flp的动物中，导致仅在这些细胞中进行基因表达。

3、血清型：衣壳蛋白是rAAV载体非常重要的组分，它可以驱动这些载体的生物学功能。虽然多项研究表明不同的血清型在感染不同类型细胞的能力方面存在差异，但最近的一项研究表明，大多数（或所有）血清型使用相同的受体（AAVR）（Pillay et al., 2016）。观察到的这种趋向性可能是由于其他因素，例如病毒体附着到细胞表面，或者可能是进入后的步骤，例如：脱壳。

AAV术语可能令人困惑。您可能会看到AAV2/2或AAV2/8等名称，但这些数字实际上意味着什么？第一个数字代表反向末端重复（ITR）类型。ITRs是AAV基因组侧端的短DNA序列，允许其在宿主细胞中形成多联体。它们与Rep蛋白一起促进基因与人类基因组在第19号染色体上AAVS1位点的整合，这种情况只能在野生型AAV中观察到 - 而不是载体形式。几乎所有载体都含有2型ITR。2型ITR可以与各种衣壳类型一起包装。用于包装rAAV载体的衣壳类型，即血清型-由第二个数字表示。例如，如果rAAV载体具有类型2的ITR和类型8的衣壳，则其将表示为AAV2/8。

4、基因组：野生型AAV是单链DNA病毒。在脱壳DNA后，病毒依赖宿主细胞复制机制来合成互补DNA链。该步骤被认为是rAAV的转导效率的限制因素。为了克服这个问题，科学家（McCarty et al）通过改变一种ITRs来合成二聚体或自身互补的AAV（称为scAAV）。scAAV载体比ssAAV能更快速起效（几天）且具有更高水平的转基因表达。然而，它们的基因载量（<2.5Kb）是ssAAV（<4.8Kb）的一半，这限制了可成功包装的基因和调控元件的数量。

如果您需要快速转基因表达，scAAV可能很适用。较低的滴度就可能达到所需的转基因表达水平，从而减小由于高病毒浓度带来的毒性或免疫原性。

Figure 1: Comparison of ssAAV and scAAV genomes, packaging, and transduction. From Takashi Okada (2013). Efficient AAV Vector Production System: Towards Gene Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy, Gene Therapy - Tools and Potential Applications, Dr. Francisco Martin (Ed.), InTech, DOI:10.5772/53023

生产你的rAAV

全世界有几个公司，您可以从这些地方获得优质，高滴度的rAAV（包括Addgene！），当然您也可以使用标准的分子生物学方法和组织培养经验在您自己的实验室中生成rAAV。

简而言之，您首先用携带目的基因的rAAV载体，腺病毒辅助质粒和含有Rep和Cap的质粒共转染HEK293T细胞（图2，通常称为“三重质粒转染”）。2-3天后，收集上清液（或在某些情况下需要制备细胞提取物，因为一些rAAV血清型被释放到培养基中，而其他类型则没有）（Vandenberghe et al），使用PEG从中沉淀病毒粒子。然后使用高速的超速离心机通过密度梯度离心进一步纯化病毒颗粒。由于其密度很高，病毒粒子会在分离液中形成一条带，你可以收集这条带。然后通过透析/缓冲液交换去除密度梯度离心液，并且如果需要可以进一步浓缩病毒粒子。

Figure 2: Recombinant AAV (rAAV) transfer vectors typically carry a transgene driven by a promoter of choice between ITRs, but do not encode Rep/Cap. Rep/Cap ORFs encode proteins essential for viral genome replication, virion assembly, and the 60 mer viral capsid. In this case, Rep/Cap are encoded by plasmids that are co-transfected with the transgene plasmid in tissue culture. Also needed for replication is an adenoviral helper plasmid, which induces the lytic life cycle for the AAV, and its release.

体内递送rAAV

关于AAV在体内的传递，有几个因素是不同的，这取决于您选择的生物系统。这些因素对感染的成功程度有很大的影响。无论您的应用是什么，下面列出的一些参数，您可能需要在注射病毒之前考虑：

1、注射滴度：到达组织的病毒颗粒的数量，将取决于您的病毒制备的滴度和可以递送的最大体积，并且这些非常重要。不幸的是，如上所述，病毒的滴度不能直接转化为您在体内观察到的现象，尽管它是一个起点。您可以首先搜索文献以获取有关病毒在特定组织中的建议，但通常需要通过尝试一系列稀释浓度来确定在体内的最佳剂量。

2、动物的年龄：首先，重要的是要记住末期分化细胞（即有丝分裂后期细胞）将具有长期AAV表达能力，但是在分裂细胞中，表达能力将会丧失。待注射动物的年龄将确定您可以成功感染的细胞类型（即在早期发育时间点，尚未出生的细胞，即使其有丝分裂祖细胞存在，也不能被AAV感染）（Xiong and Cepko）。

3、感染的可视化：在开始感染过程之前，您还应该考虑如何可视化您的rAAV感染。您是否在rAAV构建体中包含了报告基因，例如GFP或mCherry？能够通过荧光测量直接观察到病毒表达发生的位置。如果没有，您可以考虑在驱动您感兴趣的基因的同一启动子下共同注射携带报告基因的AAV，并测量报告基因表达作为您感兴趣的不易检测基因的代表。如果无法进行共表达或共感染，通过免疫组化或原位杂交检测目的蛋白可能是您最好的选择。

4、感染后的时间：注射和组织处理之间需要适当的时间来检测AAV介导的基因表达。时间将高度取决于衣壳类型和您感染的组织。等待~2周是许多组织的较好选择。据报道，AAV介导的基因表达非常稳定，在人类临床试验和狗中持续数年（Wonjo et al）。

AAV是用于病毒基因传递的极其通用的工具。您特定研究应用的要求将决定AAV设计和递送的参数。虽然您的最终血清型/滴度/年龄测定将严重依赖于预实验，但您可以查看越来越多的文献，了解不同生物系统的设计建议方案。在过去的二十年中，有超过一百个涉及AAV的临床试验，这个工具似乎在未来几年仍是治疗和基础研究环境中的热点。

【参考文献】

1. Atchison, Robert W., Bruce C. Casto, and William McD Hammon. “Adenovirus-associated defective virus particles.” Science 149.3685 (1965): 754-755. PubMed PMID: 14325163.

2. Pillay, S., et al. “An essential receptor for adeno-associated virus infection.” Nature 4:520(7588):108-12 (2016). PubMed PMID: 26814968.

3. McCarty, D. M., Paul E. Monahan, and Richard J. Samulski. “Self-complementary recombinant adenoassociated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis.” Gene therapy 8.16 (2001). PubMed PMID: 11509958.

4. Vandenberghe, Luk H., et al. “Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.” Human gene therapy 21.10 (2010): 1251-1257. PubMed PMID: 20649475. PubMed Central PMCID: PMC2957237.

5. Veldwijk, Marlon R., et al. “Development and optimization of a real-time quantitative PCR-based method for the titration of AAV-2 vector stocks.”Molecular Therapy 6.2 (2002): 272. PubMed PMID: 12349826.

6. Xiong, Wenjun, and Constance Cepko. “Distinct expression patterns of AAV8 vectors with broadly active promoters from subretinal injections of neonatal mouse eyes at two different ages.” Retinal Degenerative Diseases. Springer International Publishing, 2016. 501-507. PubMed PMID: 26427452.

7. Okada, Takashi. Efficient AAV Vector Production System: Towards Gene Therapy For Duchenne Muscular Dystrophy. INTECH Open Access Publisher, 2013. Intech Webpage.

8. Wojno, Adam P., Eric A. Pierce, and Jean Bennett. “Seeing the light.” Science translational medicine 5.175 (2013): 175fs8-175fs8. PubMed PMID: 23467559.

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